支原體qPCR法介紹：

熒光定量PCR法（qPCR）：是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上，將『針對(duì)支原體特異性保守序列的探針』做熒光標(biāo)記，使PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物帶有熒光，利用熒光信號(hào)的變化和配套軟件，進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測，簡稱qPCR。

優(yōu)點(diǎn)：

①靈敏度高、特異性強(qiáng)。

②時(shí)間短，2-3小時(shí)出結(jié)果

③檢測結(jié)果可定量

④操作簡便

缺點(diǎn)：

①對(duì)于已做支原體滅活處理的樣品，由于支原體DNA仍舊存在其中，PCR結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假陽性。（可用培養(yǎng)法做補(bǔ)充驗(yàn)證）

②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大（由于引物及內(nèi)在設(shè)計(jì)不同），需謹(jǐn)慎選擇，盡量在專業(yè)人員推薦指導(dǎo)下使用。

操作步驟

第1步：樣本處理

a.細(xì)胞培養(yǎng)上清

b. 生物藥或需遵循藥典的樣本

說明：①樣品基質(zhì)可能會(huì)影響檢測的靈敏度。收集和篩選更高的樣品量可提高測定靈敏度。

②細(xì)胞培養(yǎng)物樣本含豐富的DNA酶，在低溫下也能降解支原DNA，影響檢測靈敏度。

建議：樣本做DNA抽提處理，實(shí)現(xiàn)最高靈敏度。

推薦：德國MB公司生產(chǎn)的專用支原體DNA提取試劑盒

Venor® Gem Sample Preparation Kit

該DNA抽提試劑盒已經(jīng)過廣泛驗(yàn)證。

第2步：試劑制備

a.凍干粉溶解

b. 反應(yīng)體系制備

b1) 樣品為細(xì)胞上清篩查——反應(yīng)體系制備

b2) 樣品為生物藥——反應(yīng)體系制備

第3步：啟動(dòng)熒光定量PCR儀

第4步：結(jié)果判別

FAM通道：檢測支原體熒光信號(hào)。HEX通道：檢測內(nèi)控對(duì)照熒光信號(hào)。

支原體DNA和內(nèi)控DNA存在信號(hào)的競爭性抑制。

支原體DNA越多，F(xiàn)AM通道信號(hào)越高，檢測內(nèi)控對(duì)照的HEX通道信號(hào)越低。

定量需基于Ct值和DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Ct＜40為陽性結(jié)果。Ct≥40為陰性結(jié)果