細胞復(fù)蘇是一簡單的試驗操作，但操作中有許多需要注意的事項，在實驗操作中注意細小問題，才能使復(fù)蘇后的細胞狀態(tài)保持良好。現(xiàn)將細胞復(fù)蘇的操作程序和注意事項總結(jié)如下。

1. 細胞實驗室進行常規(guī)消毒，紫外照射30 min以上，超凈臺開啟通風(fēng)10 min。

2. 將新鮮培養(yǎng)基置于37℃恒溫水浴鍋中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭，移入無菌操作臺內(nèi)。將10 ml左右新鮮培養(yǎng)基移入無菌細胞培養(yǎng)瓶中，備用。

3. 從液氮保存罐中取出凍存管，立即放入40℃水浴中，輕搖冷凍管使其在快速全部融化，以70 % 酒精擦拭凍存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

4. 將細胞懸液移入已加培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)瓶中，放CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

5. 待細胞貼壁后（根據(jù)細胞種類貼壁時間不同，一般4小時左右），棄去含有冷凍保護劑的培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

【注意事項】

1. 取細胞的過程中注意帶好防凍手套，護目鏡。細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導(dǎo)致爆炸。

2. 常溫下二甲基亞砜（DMSO）對細胞的毒副作用較大，因此，必須在1~2 min內(nèi)使凍存液*融化。如果復(fù)蘇溫度太低，會造成細胞的損傷，所以選擇40℃復(fù)蘇。

3. 貼壁細胞復(fù)蘇實驗標(biāo)準(zhǔn)流程是將解凍后的細胞懸液先進行離心，以去除冷凍保護液DMSO對細胞的損傷，但是離心也會對剛復(fù)蘇的狀態(tài)欠佳的細胞產(chǎn)生損傷。也有的實驗操作是將解凍后的細胞懸液先直接吹打均勻后分裝到培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，第二天換液。這可能使培養(yǎng)基中少量的DMSO對細胞造成損傷。

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